Eric Betzig hatte nicht erwartet, das experiment zu arbeiten.
Zwei Wissenschaftler, Ruixuan Gao und Shoh Asano, wollte mit seiner Mannschaft Mikroskop auf Gehirn-Proben erweitert, um vier mal Ihre übliche Größe — aufgeblasen wie Ballons. Das duo, Teil des Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Investigator Ed Boyden ‚ s lab am Massachusetts Institute of Technology (MIT), verwendet ein chemisches Verfahren, um kleine Proben größer, so können die Wissenschaftler sehen leichter molekularen details.
Ihre Technik, genannt ausbau-Mikroskopie, arbeitete auch auf einzelne Zellen oder dünne gewebeschnitte abgebildet in der konventionellen Lichtmikroskopie, sondern deren team wollte Bild weitaus größere Abschnitte von Gewebe. Sie wollte sehen, komplette neuronale schaltkreise spanning Millimeter oder mehr. Brauchten die Wissenschaftler ein Mikroskop, das war high-speed, hohe Auflösung, und relativ sanft — etwas nicht zu zerstören, eine Probe, bevor Sie beenden konnte imaging.
Also, Sie wandte sich an Betzig. Sein team an der HHMI ‚ s Janelia Research Campus angewendet hatte Ihre Gitter-light-sheet-Mikroskop-Bild der schnelle subzelluläre Dynamik von empfindlichen lebenden Zellen in 3-D. die Kombination der beiden Mikroskopie-Techniken potenziell bieten schnelle, detaillierte Bilder von breiten Schwaden von Gehirn Gewebe.
„Ich dachte, Sie waren voll davon,“ Betzig erinnert. „Die Idee klingt ein wenig plump,“, sagt Gao. „Wir sind stretching Gewebe auseinander.“ Aber Betzig eingeladen Gao und Asano, zu versuchen, die Gitter-Rahmen aus.
„Ich wollte Ihnen zeigen,“ Betzig lacht. Stattdessen war er hin und Weg. „Ich konnte nicht glauben, dass die Qualität der Daten, die ich sah. Sie haben könnte, klopfte mir vorbei mit einer Feder.“
Nun, er und seine Janelia Kollegen haben gemeinsam mit Boyden-Gruppe und fotografierten das gesamte Drosophila Gehirn und die Abschnitte von Gehirn der Maus die Dicke des Kortex. Ihre kombinierte Methode bietet eine hohe Auflösung mit der Fähigkeit zu visualisieren jedes gewünschte protein — und es ist auch Recht schnell. Imaging the fly Gehirn in mehreren Farben dauerte nur 62.5 Stunden, im Vergleich zu den Jahren, die es dauern würde, mit einem Elektronen-Mikroskop Boyden, Betzig, und Ihre Kollegen berichten 17. Januar 2018, in der Fachzeitschrift Science.
„Ich sehe uns immer zu dem Punkt, an imaging mindestens 10 Fliegen Gehirne pro Tag“, sagt Betzig, jetzt ein HHMI Ermittler an der University of California, Berkeley. Eine solche Geschwindigkeit und Auflösung lassen die Wissenschaftler neue Fragen zu stellen, sagt er, wie die Gehirne unterscheiden sich zwischen Männchen und Weibchen, oder wie schaltkreise im Gehirn, die variieren zwischen Fliegen des gleichen Typs.
Boyden Gruppe träumt davon, eine Karte des Gehirns, so detailliert Sie können die Simulation in einem computer. „Wir haben eine Schwelle überschritten, die in imaging-Leistung“, sagt er. „Das ist, warum wir sind so aufgeregt. Wir sind nicht nur Scannen schrittweise mehr Gehirn-Gewebe, wir Scannen gesamte Gehirn.“
Die Erweiterung des Gehirns
Detaillierte Karten des Gehirns erfordert charting Ihre Tätigkeit und Verdrahtung-in Menschen, die Tausende von verbindungen, die von jedem der mehr als 80 Milliarden Neuronen. Solche Karten könnten den Wissenschaftlern helfen, spot, wo die Erkrankung des Gehirns beginnt, bessere künstliche Intelligenz, oder sogar zu erklären, Verhalten. „Das ist wie der Heilige Gral der Neurowissenschaft,“ Boyden sagt.
Vor Jahren, seine Gruppe hatte eine Idee, um herauszufinden, wie alles organisiert war: Was ist, wenn Sie könnte tatsächlich das Gehirn größer, groß genug, nach innen zu schauen? Durch Infusion von Proben mit swellable Gele — wie das Zeug in baby-Windeln-das team erfand eine Weise zu erweitern, Geweben, so dass die Moleküle innerhalb weniger überfüllt und leichter zu sehen, unter dem Mikroskop. Moleküle, die Sperre in eine gel-Gerüst, wobei die gleichen relativen Positionen selbst nach der expansion.
Aber es war nicht einfach, Bild, große Gewebe-Volumen. Je dicker eine Probe bekommt, desto schwieriger ist es, zu beleuchten, nur die Teile, die Sie sehen wollen. Scheint zu viel Licht auf die Proben können photobleach Sie, brennen die Leuchtstoffröhren „Birnen“ die Wissenschaftler verwenden, um Licht Zellen.
Ausbau einer Stichprobe nur vier-fache erhöht sein Volumen 64-Fach, so-imaging-Geschwindigkeit wird auch paramount, Gao sagt. „Wir brauchten etwas, das war schnell und hatte nicht viel photobleaching, und wir wussten, es war ein Super-Mikroskop an Janelia.“
Die Gitter-light-sheet-Mikroskop fegt eine hauchdünne Blatt von Licht durch eine Probe, die Beleuchtung wird nur der Teil unter dem Mikroskop, die Ebene des Fokus. Das hilft out-of-focus Bereiche dunkel bleiben, halten einer Probe Fluoreszenz wird gelöscht.
Wenn Gao und Asano zum ersten mal getestet Ihre erweiterte Maus-Gewebe an den Gitter-Rahmen, sahen Sie ein Dickicht von leuchtenden Noppen ragen aus Neuronen, die “ äste. Diese Noppen, die sogenannten dendritischen Dornen, die oft Aussehen wie Pilze aus dem Boden, mit knolligen Köpfe auf dünnen Hälsen, die hart sein können zu Messen. Aber die Wissenschaftler waren in der Lage, um zu sehen, auch „die kleinste Hälse möglich,“ Asano sagt, während Sie gleichzeitig imaging synaptischen Proteinen in der Nähe.
„Es war unglaublich beeindruckend“, sagt Betzig. Das team war überzeugt, dass Sie sollten erkunden Sie die kombinierte Technik weiter. „Und das ist, was wir getan haben, seitdem“, sagt er.
Das Gehirn und darüber hinaus
In den letzten zwei Jahren, Gao und Asano haben Monate damit verbracht, an Janelia, die Zusammenarbeit mit Biologen, microscopists, Physiker und Informatiker über den campus zu erfassen und zu analysieren, Bilder. „Das ist wie ein Avengers-level-Zusammenarbeit,“ Gao sagt, bezieht sich auf die crew von comic-Superhelden.
Yoshinori Aso und die FlyLight-team zur Verfügung gestellt high-quality-fly Gehirn Exemplare, die Gao und Asano ausgebaut und zu sammeln, um rund 50.000 cubes von Daten über jede Gehirn-bilden eine Art 3-D-puzzle. Die Bilder aufwändig computational Nähte die einzelnen Teile wieder zusammen, Arbeit unter der Leitung von Stephan Saalfeld und Igor Pisarev. „Stephen und Igor rettete uns den Speck“, sagt Betzig. „Sie befassten sich mit all den schrecklichen kleinen details in der Bildverarbeitung und machte es auf jeden multi-terabyte data set.“
Als Nächstes Srigokul Upadhyayula von der Harvard Medical School, co-erste Autor des Berichts analysiert, die kombiniert 200 Terabyte Daten und erstellt die atemberaubende Filme, die Schaufenster das Gehirn die Feinheiten in lebendigen Farben. Er und seine Mitautoren untersuchten mehr als 1.500 dendritischen Dornen, abgebildet fetthaltigen Hüllen, isolieren Maus Nervenzellen, markiert alle die dopaminergen Neuronen, und zählte all die Synapsen, die über das gesamte Gehirn Fliegen.
Die Nuancen der Boyden – team-Erweiterung Technik machen es gut geeignet für den Gitter-Rahmen; die Technik produziert fast transparenten Proben. Für das Mikroskop, es ist fast, als würde man durch Wasser, sondern als ein trübes Meer von molekularen Substanzen. „Das Ergebnis ist, dass wir, um kristallklare Bilder bei blitzschnellen Geschwindigkeiten über sehr große Volumina im Vergleich zu früheren Mikroskopie-Techniken,“ Boyden sagt.
Dennoch bleiben Herausforderungen bestehen. Wie bei jeder Art von super-resolution-Fluoreszenz-Mikroskopie, Betzig sagt, es kann schwierig sein, zu schmücken Proteine mit genügend fluoreszierenden Lampen, um Sie deutlich sehen, bei hoher Auflösung. Und seit dem ausbau der Mikroskopie erfordert viele Verarbeitungsschritte, es gibt immer noch das potential für Artefakte eingeführt werden. Denn dieser, sagt er, „wir arbeiteten sehr hart, um zu überprüfen, was wir getan haben, und andere wären gut beraten, dasselbe zu tun.“
Nun, Gao und das Janelia-team bauen ein neues Gitter-light-sheet-Mikroskop, das Sie verschieben möchten, um Boyden lab am MIT. „Unsere Hoffnung ist es, schnell Karten des gesamten Nervensystems,“ Boyden sagt.