Engineering ‚Haarnadeln‘ erhöht CRISPR Genauigkeit: Hinzugefügte Stück von RNA-könnte zur Verbesserung der Genauigkeit der CRISPR das 50-fache

Biomedizinische Ingenieure an der Duke University haben eine Methode entwickelt, die für die Verbesserung der Genauigkeit der CRISPR-Genom-editing-Technologie von durchschnittlich 50-fache. Sie glauben, es kann leicht übersetzt werden zu jedem Bearbeitungs-Technologie kontinuierlich erweitert Formate.

Der Ansatz fügt eine kurze Rute um die guide-RNA, die verwendet wird zum identifizieren einer Sequenz von DNA für die Bearbeitung. Diese zusätzlichen Schwanz Falten zurück und bindet auf sich selbst, die Schaffung eines „lock“ – das kann nur rückgängig gemacht werden, indem die zielgerichtete DNA-Sequenz.

Die Studie erscheint online am 15 April in der Zeitschrift Nature Biotechnology.

„CRISPR ist in der Regel unglaublich präzise, aber es gibt Beispiele, die gezeigt haben dass off-target-Aktivität, so gab es ein breites Interesse über das Feld in der Erhöhung der Spezifität,“ sagte Charles Gersbach, die Rooney Familie Associate Professor für Biomedizinische Technik an der Duke. „Aber die Lösungen, die vorgeschlagen, die bisher nicht übersetzt werden zwischen verschiedenen CRISPR-Systeme.“

CRISPR/Cas9 ist ein Verteidigungssystem, das Bakterien nutzen, um den Gegner-und Spalten die DNA von eindringenden Viren. Während die erste version der CRISPR-Technologie entwickelt, um die Arbeit in menschlichen Zellen stammt von einem Bakterium namens Streptococcus pyogenes, viele weitere Bakterien-Spezies tragen andere Versionen.

Wissenschaftler auf dem Feld haben Jahre damit verbracht, auf der Suche nach neuen CRISPR-Systeme mit gewünschten Eigenschaften und sind ständig auf hinzufügen, um das CRISPR arsenal. Zum Beispiel, einige Systeme sind kleiner und besser in der Lage, passen in einen viralen Vektor zu liefern, um menschliche Zellen für die gen-Therapie. Aber egal, Ihre individuellen Fähigkeiten, alle produziert haben unerwünschte genetische änderungen mal an.

Eine Universelle Eigenschaft von CRISPR-Systeme ist die Verwendung von RNA-Molekülen, die als Führer, die zu Hause in auf die Ziel-DNA-Sequenz im Genom. Einmal in der guide-RNA findet seine Ergänzende genetische Sequenz, die Cas9-Enzym wirkt als die Scheren, die machen den Schnitt in der DNA, die Erleichterung von änderungen der Genom-Sequenz. Aber da jede homing-Sequenz ist nur 20 Nukleotide lang und das menschliche Genom enthält ungefähr drei Milliarden Basenpaare, es gibt eine Menge zu Sortieren, und die CRISPR können manchmal Fehler machen, mit Sequenzen einer oder zwei base-Paare geringeres als Perfektion.

Eine Möglichkeit zur Verbesserung CRISPR ist eine Präzision erfordern zwei Cas9-Moleküle zu binden, die auf gegenüberliegenden Seiten der gleichen DNA-Sequenz, die für einen kompletten cut gemacht werden. Obwohl dieser Ansatz funktioniert, es fügt weitere Teile, um das system, die Steigerung Ihrer Komplexität und macht es schwieriger, zu liefern.

Ein weiterer Ansatz ist die genetisch-Ingenieur das Cas9-proteins zu machen, weniger energisch, so dass es weniger wahrscheinlich zu springen die Waffe und einen Fehler machen. Dies hat auch gezeigt, vielversprechende Ergebnisse, diese Art von protein engineering “ ist mühsam und solche Bemühungen sind spezifisch für jede CRISPR-system.

„Wie es scheint, gibt es eine neue CRISPR-system entdeckt, fast jede Woche, die hat eine einzigartige Eigenschaft macht es sinnvoll, für eine bestimmte Anwendung“, sagte Gersbach. „Dadurch umfangreiche re-engineering-jedes mal finden wir eine neue CRISPR-protein, um es genauer ist, nicht eine einfache Lösung.“

„Wir konzentrieren uns auf eine Lösung, die nicht mehr Teile und ist allgemein auf jede Art von CRISPR-system“, sagte Dewran Kocak, der Doktorand arbeitet in Gersbach ‚ s Labor, die dieses Projekt geführt. „Was ist allen gemeinsam CRISPR-Systeme ist die guide-RNA, und diese kurzen RNAs sind viel einfacher zu konstruieren.“

Gersbach und Kocak ‚ s Lösung ist die Erweiterung der guide-RNA von nicht weniger als 20 Nukleotide, so dass es Falten wieder auf sich selbst und bindet sich an das Ende des ursprünglichen guide RNA, bildet eine Haarnadel-Form. Dies schafft eine Art von Sperre, die sehr schwer zu verdrängen, wenn sogar nur ein einzelnes Basenpaar ist falsch, in eine DNA-Sequenz geprüft wird, die für eine mögliche schneiden. Aber da der guide RNA lieber an DNA zu binden statt sich selbst, die richtige Kombination der DNA ist immer noch in der Lage, um die Sperre zu brechen.

„Wir sind in der Lage, eine Feinabstimmung der Stärke der lock-gerade genug, so dass die guide-RNA noch funktioniert, wenn es erfüllt seine richtige Wort“, sagte Kocak.

In der Papier -, Kocak und Gersbach zeigen, dass diese Methode kann zur Erhöhung der Genauigkeit der Schnitte, die in menschlichen Zellen um durchschnittlich das 50-fache in fünf verschiedenen CRISPR-Systeme abgeleitet von vier verschiedenen Bakterienstämmen. Und in einem Fall, dass die Verbesserung stieg auf über 200 Fach.

„Es ist eine ziemlich einfache Idee, auch wenn Dewran abgeschlossen mehrere Jahre im Wert von Forschung zu zeigen, dass es funktioniert die Weise, die wir denken, dass es funktioniert“, sagte Gersbach. „Es ist eine schöne, elegante Lösung für das loswerden von off-target-Aktivität.“

Vorwärts bewegend, hoffen die Forscher, zu sehen, wie viele verschiedene CRISPR Varianten dieser Ansatz konnte mit der Arbeit als auch komplette eine eingehende Charakterisierung der genau wie die Verriegelung arbeitet, um zu sehen, ob es Unterschiede in CRISPR-Varianten. Und weil diese Experimente wurden in kultivierten Zellen, die Forscher sind gespannt, wie gut dieser Ansatz könnte zu erhöhen CRISPR Genauigkeit in einem tatsächlichen Tiermodell der Krankheit.