Neue Methode zu finden, um off-target-Effekte von CRISPR: Forscher entdecken, wie zu identifizieren, die off-target-Schaden, verursacht durch CRISPR-Genom-Bearbeitung

Da die CRISPR-Genom-editing-Technologie erfunden wurde, in 2012, es hat gezeigt, große Versprechen für die Behandlung einer Reihe von hartnäckigen Krankheiten. Aber Wissenschaftler haben gekämpft, um zu identifizieren, potenzielle off-target-Effekte in therapeutisch relevante Zelltypen, die immer noch die wichtigste Barriere zu bewegen Therapien in die Klinik. Nun, eine Gruppe von Wissenschaftler der Gladstone Institute und der Innovativen Genomics Institute (IGI), mit Mitarbeitern bei AstraZeneca, haben entwickelte eine zuverlässige Methode, um genau das zu tun.

CRISPR Bearbeitungen, die das Genom einer person, die durch das schneiden der DNA an einem bestimmten Ort. Die Herausforderung ist es sicherzustellen das tool nicht auch Kürzungen anderswo entlang der DNA — Schäden bezeichnet als „off-target-Effekte“ das könnte unvorhergesehene Folgen haben.

In einer Studie, die morgen veröffentlicht werden in der Zeitschrift Science, die beiden ersten Autoren, Beeke Wienert und Stacia Wyman, eine neue Methode gefunden, dieses problem anzugehen.

„Wenn CRISPR macht einen Schnitt, die DNA gebrochen ist“, sagt Wienert, PhD, wer begann die Arbeit in Jacob E. Mais IGI-Labor und der jetzt ein Postdoc-Stipendiat in Bruce R. Conklin Labor in Gladstone. „So, um zu überleben, die Zelle Rekruten viele verschiedene DNA-Reparatur-Faktoren, die zu diesem bestimmten Ort im Genom zu reparieren die Pause und kommen die abgeschnittenen enden wieder zusammen. Wir dachten, dass, wenn wir finden könnten, die Standorte dieser DNA-Reparatur-Faktoren, die wir erkennen könnten, die Seiten geschnitten wurden durch CRISPR.“

Testen Sie Ihre Idee, untersuchten die Forscher ein panel von verschiedenen DNA-Reparatur-Faktoren. Sie fanden heraus, dass einer von Ihnen, genannt MRE11, ist einer der Ersthelfer auf der Website von cut. Mit MRE11, entwickelten die Wissenschaftler eine neue Technik namens ENTDECKEN-Seq, identifizieren können, dass die genaue Websites im Genom, wo ein Schnitt gemacht wurde, indem CRISPR.

„Das menschliche Genom ist sehr groß-wenn Sie gedruckt haben, die gesamte DNA-Sequenz, Sie würde am Ende mit einem Roman so hoch wie ein 16-stöckiges Gebäude“, erklärt Conklin, MD, senior investigator bei Gladstone und stellvertretender Direktor im IGI. „Wenn wir wollen, zu schneiden der DNA mit CRISPR, es ist wie wir zu entfernen versuchen ein bestimmtes Wort auf einer bestimmten Seite in diesem Roman.“

„Sie können denken, der DNA-Reparatur-Faktoren, wie unterschiedliche Arten von Lesezeichen Hinzugefügt, um das Buch,“ Conklin hinzu. „Während einige Lesezeichen ein ganzes Kapitel, MRE11 ist ein Lesezeichen, das einen Drilldown zu den genauen Brief als geändert wurde.“

Verschiedene Methoden, die derzeit vorhanden sind zu erkennen CRISPR off-target-Effekte. Jedoch, Sie kommen mit Einschränkungen, die Palette aus der Produktion von falsch-positiven Ergebnissen zu töten die Zellen, die Sie untersuchen. Darüber hinaus die häufigste Methode verwendet, um Datum ist derzeit begrenzt zu sein, die Sie in kultivierten Zellen im Labor, ohne die seine Verwendung in der Patienten-abgeleiteten Stammzellen oder tierischen Gewebe.

„Weil unsere Methode stützt sich auf die Zelle, die die natürlichen Reparatur-Prozess zu identifizieren schneidet, hat es sich bewährt, viel weniger invasiv und viel mehr zuverlässig“, sagt Mais, PhD, die läuft jetzt in einem Labor der ETH Zürich. „Wir waren in der Lage, um testen Sie unsere neue ENTDECKEN-Seq-Methode in induzierte pluripotente Stammzellen, Patienten-Zellen und Mäuse, und unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Methode könnte möglicherweise verwendet werden, in jedem system, nicht nur im Labor.“

Die ENTDECKEN-Seq-Methode, angewandt, um neue Zelltypen und-Systeme, hat auch gezeigt, neue Einblicke in die Mechanismen, die von CRISPR Bearbeiten das Genom, führt zu einem besseren Verständnis der Biologie, wie dieses tool funktioniert.

„Die neue Methode vereinfacht den Prozess der Identifizierung von off-target-Effekte, während auch die Erhöhung der Genauigkeit der Ergebnisse“, sagt Conklin, der auch ein professor der medizinischen Genetik und molekulare Pharmakologie an der UC San Francisco (UCSF). „Dies könnte es uns ermöglichen, bessere Vorhersagen, wie genome editing arbeiten würde, in einer klinischen Einstellung. Als Ergebnis, es stellt einen wesentlichen Schritt in der Verbesserung der Prä-klinischen Studien und bringen CRISPR-basierte Therapien näher zu den Patienten im Bedarf.“